黃曲霉M1快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲M1將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭黃曲M1抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲M1的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物黃曲M1的含量。

二、試劑盒特性

1. 試劑盒靈敏度：  0.03ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～15min

1. 樣本檢測下限

牛 奶 ······································ 0.3 ppb

奶 粉 ······································ 0.12ppb

1. 交叉反應率

黃曲 M1 ···································· 100%

1. 樣本回收率

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl

試 劑：乙腈、乙酸乙酯

五、樣本前處理步驟

1. 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

1. 樣本前處理需配制：配液 1 樣本復溶液：

用去離子水將 2×濃縮復溶液按 1：1 稀釋。

配液 2  樣本提取液：

將乙腈與乙酸乙酯按 1:2 比例混合均勻（1份乙腈+2 份乙酸乙酯）。

1. 樣本處理：

（a）牛奶樣本處理方法（適用于乳飲料）：

1、 取牛奶樣本 100µl，加入 900µl 去離子水，充分

振蕩混勻；2、 取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數:  10 倍

（b） 奶粉樣本處理方法：

1、 取 1.0±0.05g 奶粉樣本于 50ml 離心管中；加入3ml 去離子水，再加入 8ml 樣本提取液，充分振蕩 3min，20℃ 4000r/min 以上離心 10min；2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；3、 用 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加入 1ml樣本復溶液充分混合 30s；20℃ 4000r/min 以上離心 10min；去除上層正己烷相；

4、 取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數：4 倍

六、 酶標免疫分析程序:

1. 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

1. 操作步驟：

1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2～8℃。

3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物 50µl/孔，再加入 50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應 30min。

6、 將孔內液體甩干，用稀釋后的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。

8、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲M1 量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243；0.03ppb 為 1.816；0.06ppb 為 1.415； 0.12ppb 為 0.74；0.24ppb 為 0.313；0.48ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 0.24ppb～0.48ppb；樣本 2

的濃度范圍是 0.06ppb～0.12ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲M1 實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100%

B₀

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲M1標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲M1 實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析. 

八、 注意事項

1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒理想反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

農業(yè)部生物毒素檢測重點實驗室       聯(lián)合研制     

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